慧穎生物淺談細(xì)胞破碎技術(shù)

1引言：

自年代初重組技術(shù)得到廣泛應(yīng)用以來(lái)，生物技術(shù)發(fā)生了質(zhì)的飛躍, 生物產(chǎn)品的數(shù)量越來(lái)越多，許多具有重大應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生，如具有顯著醫(yī)療作用的胰島素、干擾素、生長(zhǎng)激素、白細(xì)胞介素一等, 它們的基因分別在宿主細(xì)胞如（大腸桿菌或酵母細(xì)胞）內(nèi)克隆表達(dá)成為基因工程產(chǎn)物，從而提高了產(chǎn)量，降低了成本。很多基因工程產(chǎn)物都是胞內(nèi)物質(zhì)如上述藥物經(jīng)克隆表達(dá)后都屬胞內(nèi)物質(zhì)，分離提取這類(lèi)產(chǎn)物時(shí)，必須將細(xì)胞破壁，使產(chǎn)物得以釋放，才能進(jìn)一步提取。因此細(xì)胞破碎是提取胞內(nèi)產(chǎn)物的關(guān)鍵性步驟，破碎技術(shù)的研究更加引起基因工程專(zhuān)家和生化工程學(xué)者的關(guān)注。

2 細(xì)胞破碎技術(shù)的概述：

細(xì)胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來(lái)的技術(shù)，是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。 結(jié)合重組DNA技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)上的重大進(jìn)展，以前認(rèn)為很難獲得的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)。目前已發(fā)展了多種細(xì)胞破碎方法，以便適應(yīng)不同用途和不同類(lèi)型的細(xì)胞壁破碎。破碎方法可規(guī)納為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類(lèi)。細(xì)胞的機(jī)械破碎主要有高壓勻漿法、珠磨法、撞擊破碎法和超聲波破碎法等方法，本文主要介紹高壓勻漿法和珠磨法。

3 高壓勻漿法：

高壓勻漿法是大規(guī)模破碎細(xì)胞的常用方法，高壓勻漿器是該法所采用的設(shè)備，它由高壓泵和勻漿閥組成。它是利用高壓迫使懸浮液通過(guò)針形閥，由于突然簡(jiǎn)壓和高速?zèng)_擊撞擊造成細(xì)胞破裂，在高壓勻漿器中，細(xì)胞經(jīng)歷了高速造成的剪切、碰撞和由高壓到常壓的突變，從而造成細(xì)胞壁的破壞，細(xì)胞膜隨之破裂，胞內(nèi)產(chǎn)物得到釋放。

3.1破碎機(jī)理

同所有的機(jī)械破碎方式一樣，高壓勻漿法破碎細(xì)胞實(shí)質(zhì)上是將細(xì)胞壁和膜撕裂，靠胞內(nèi)的滲透壓使其內(nèi)含物全部釋放出來(lái)。破碎的難易程度無(wú)疑由細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度決定，而細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度則由微生物的形態(tài)和生理狀態(tài)決定。因此細(xì)胞的培養(yǎng)條件, 包括培養(yǎng)基限制型或復(fù)合型、生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)期、靜止期、稀釋率等, 都對(duì)細(xì)胞破碎有影響胞內(nèi)物質(zhì)的釋放快慢則由內(nèi)含物在胞內(nèi)的位置決定，胞間質(zhì)的釋出先于胞內(nèi)質(zhì)，而膜結(jié)合酶加zui難釋放。

3.2影響因素

影響高壓勻漿破碎的因素主要有壓力、溫度和通過(guò)勻漿器閥的次數(shù)。人們普遍關(guān)心的是活性物質(zhì)在破碎過(guò)程中的失活問(wèn)題，研究表明蛋白質(zhì)和酶的失活主要由勻漿過(guò)程中產(chǎn)生的熱引起的。如果能將溫度控制在35℃以下，那么酶活損失可以忽略。對(duì)于溫度敏感性物質(zhì), 低溫操作是必需的。高壓勻漿一般需多級(jí)操作，每次循環(huán)前往往進(jìn)行級(jí)間冷卻。盡管提高壓力有利于細(xì)胞破碎，但是提高壓力需增加能耗，同時(shí)為移走產(chǎn)生的熱量需要付出代價(jià)。高壓勻漿法的能耗主要包括提供動(dòng)力如壓力消耗的能量以及低溫操作耗費(fèi)的能量。此外，操作壓力對(duì)細(xì)胞破碎的影響要比勻漿次數(shù)的影響大得多。從提高破碎效率的角度應(yīng)選擇盡可能高的壓力；而從降低能耗及延長(zhǎng)設(shè)備壽命的角度應(yīng)避免很高的壓力。因此，工業(yè)生產(chǎn)中常采用的壓力為55~70Mpa。

3.3存在問(wèn)題

    除了較易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌以及較小的革蘭氏陽(yáng)性菌不適于用高壓勻漿器處理以外, 其它微生物細(xì)胞都可以用高壓勻漿法破碎。另外有些亞細(xì)胞器如包含體，質(zhì)地堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理。但zui近也有人在實(shí)驗(yàn)室嘗試用高壓勻漿器破碎真菌和含有包含體的大腸桿菌。

4 珠磨法：

珠磨法是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細(xì)胞獲得破碎。球磨破碎細(xì)胞的破碎率可高達(dá)95%，用于提取細(xì)胞壁，線粒體，核酸，蛋白以及其它細(xì)胞器的收率也高。用Dyno mill破碎酵母細(xì)胞提取線粒體的收率要比其它機(jī)械破碎法要高5-8倍。球磨破碎細(xì)胞應(yīng)用范圍廣，從實(shí)驗(yàn)室到大規(guī)模生產(chǎn)均可使用，并可控制系統(tǒng)及破碎工藝過(guò)程的溫度；操作系統(tǒng)密閉，可對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行滅菌，避免污染。因此，該技術(shù)和設(shè)備的發(fā)展和應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。

4.1破碎機(jī)理

高速珠磨法也是一種有效的細(xì)胞破碎方法，珠磨機(jī)是該法所用的設(shè)備。微生物細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的研磨劑通常是直徑的無(wú)鉛玻璃珠在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間以及珠子和細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞促進(jìn)細(xì)胞壁破裂,釋出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量由夾套中的冷卻液帶走。

4.2相關(guān)設(shè)備

4.2.1球磨容器

實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的容積為0.15、0.3和0.6升，工業(yè)規(guī)模的為1.4升到15升，zui大的可達(dá)265升，為帶有冷卻夾套的圓桶容器，小型的實(shí)驗(yàn)室使用的是無(wú)鉛玻璃制造，而大型的是不銹鋼制造。有通向容器內(nèi)部的菌懸液進(jìn)料口和球磨劑裝料口。依靠夾具將其固定，很容易更換。

4.2.2驅(qū)動(dòng)馬達(dá)

    驅(qū)動(dòng)馬達(dá)為三相380 V，1.85 KW，2900 rpm的電動(dòng)馬達(dá)。其主動(dòng)輪通過(guò)一個(gè)特殊的V型皮帶與攪動(dòng)軸上的被動(dòng)輪連結(jié)，利用安裝在操作馬達(dá)開(kāi)關(guān)板上的手柄，控制皮帶在主動(dòng)輪和被動(dòng)輪上的位置，改變攪動(dòng)速度。分別達(dá)到2000，3000，4500和6000轉(zhuǎn)/秒，這時(shí)的攪拌葉的線速度分別為6.7，10，15和20米/秒。

4.2.3電動(dòng)馬達(dá)的控制

控制馬達(dá)的開(kāi)關(guān)有兩個(gè)按鈕，開(kāi)和關(guān)，安培表，信號(hào)燈，在防護(hù)罩上有磁性開(kāi)關(guān)，一當(dāng)防護(hù)罩打開(kāi)，或在操作時(shí)未關(guān)上，電動(dòng)馬達(dá)不能啟動(dòng)。

4.2.4攪拌葉

由聚氨酯或不銹鋼制造的直徑為64毫米的圓盤(pán)，它們是用墊片和分離子按一定間隔距離將其固定在攪動(dòng)軸上。

4.2.5分離器

為一種狹縫分離器，它的作用是將研磨劑保留在研磨容器內(nèi)，而使破碎的細(xì)胞懸浮液流出。狹縫的寬度是利用不同厚度的標(biāo)準(zhǔn)隔片控制，分別為0.02，0.05，0.1，0.2和0.3 mm。狹縫大小的選擇取決于使用的研磨劑的粒度，一般為研磨劑直徑的三分之一。

4.2.6球磨劑

 球磨劑為無(wú)鉛玻璃制造的玻璃珠，直徑范圍zui小的為0.1mm，zui大的為1.5mm，可根據(jù)破碎的細(xì)胞種類(lèi)進(jìn)行選擇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在球磨容器內(nèi)的球磨劑裝量為研磨容器的容積的80-85%為宜。

4.2.7給料泵

為了連續(xù)破碎，可使用能調(diào)速的普通蠕動(dòng)泵，將細(xì)胞懸浮液連續(xù)輸?shù)狡扑槠鲀?nèi)，其供料速度可由需要的破碎率來(lái)控制。

4.2.8冷凍設(shè)備

由于在細(xì)胞破碎過(guò)程中高速攪拌，研磨劑與研磨劑，研磨劑與細(xì)胞之間的磨擦?xí)a(chǎn)生大量熱量，破碎過(guò)程溫度不斷升高，為避免生物活性物質(zhì)失活，對(duì)破碎系統(tǒng)進(jìn)行冷卻是十分必需的。對(duì)于Dtno-mill KDL可配用DMK 15/F型的循環(huán)流動(dòng)式制冷機(jī)，對(duì)球磨容器和細(xì)胞懸浮液儲(chǔ)存器進(jìn)行冷卻。

4.3影響因素

4.3.1細(xì)胞種類(lèi)及狀態(tài)

利用Dyno-mill KDL進(jìn)行的細(xì)胞破碎試驗(yàn)表明，不同中屬的微生物細(xì)胞在相同條件下破碎時(shí)，其破碎效率有明顯差異。差異的主要原因是不同種屬的微生物細(xì)胞的大小和形態(tài)，細(xì)胞壁或膜的結(jié)構(gòu)不同，另外，因生長(zhǎng)條件如培養(yǎng)溫度，時(shí)間，營(yíng)養(yǎng)成份不同使上述的細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)等也有差別。因此，即使在相同的破碎條件下其破碎效果也不同。換句話說(shuō)，不同種屬的微生物細(xì)胞所需的破碎條件也不相同。從大量文獻(xiàn)中可以總結(jié)出這樣的規(guī)律：按細(xì)胞破碎的難易程度是細(xì)菌＜酵母＜真菌＜藻類(lèi)。

4.3.2細(xì)胞濃度

在細(xì)胞破碎前，需用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)，比如緩沖液按細(xì)胞重量配制成一定細(xì)胞濃度的懸浮液。懸浮液要均勻，要防止有結(jié)塊和沉淀。一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的速成常數(shù)應(yīng)當(dāng)與細(xì)胞濃度無(wú)關(guān)，但在較高細(xì)胞濃度下，破碎過(guò)程細(xì)胞內(nèi)含物不斷釋放使系統(tǒng)粘度不斷升高，混合速度降低，導(dǎo)致破碎速率下降。在高細(xì)胞濃度下，zui大蛋白質(zhì)釋放量(Rm)降低，但破碎率高。低細(xì)胞濃度下，細(xì)胞的總蛋白質(zhì)釋放量高，并受流出速度影響較?。桓呒?xì)胞濃度下，細(xì)胞的總蛋白質(zhì)釋放量降低，特別是在高流出速度下，總蛋白質(zhì)釋放量隨細(xì)胞濃度增加而下降。

除了細(xì)胞濃度直接影響破碎物的粘度以外，細(xì)胞的保存狀態(tài)也影響著粘度和破碎率。細(xì)胞破碎過(guò)程中，由于粘度增加，熱傳導(dǎo)能力降低，即使在相同的冷卻條件下，破碎系統(tǒng)的溫度也會(huì)增高，溫度的增高會(huì)引起蛋白質(zhì)和酶變性，使蛋白質(zhì)和酶的總釋放量降低。

總之，在Dyno-mill上進(jìn)行細(xì)胞破碎，細(xì)胞濃度從20%增加到40%，破碎速度常數(shù)僅有很小的變化;細(xì)胞濃度增加到50%，破碎速度常數(shù)減小，破碎效率降低。高細(xì)胞濃度下，還會(huì)發(fā)生細(xì)胞破碎物沉淀和蛋白質(zhì)沉淀現(xiàn)象．一般來(lái)說(shuō)，破碎細(xì)胞濃度以40%為宜。

4.3.3球磨劑

zui常使用的球磨劑是無(wú)鉛玻璃珠，其它的還有不銹鋼珠，聚酯和聚酰胺珠等。

4.3.3.1 球磨劑顆粒大小的影響

一般使用的無(wú)鉛玻璃珠的直徑為0.1~1.5 mm，利用大腸桿菌和酵母細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞破碎率隨玻璃珠直徑的增加而降低。對(duì)于不同的細(xì)胞，由于其大小不同，使用的玻璃珠的zui適直徑也不同。大腸桿菌和陰溝腸桿菌使用0.1 mm的玻璃珠進(jìn)行破碎的效率zui高；而酵母細(xì)胞使用0.25~0.5 mm的研磨劑zui宜。

實(shí)際操作時(shí)，一般不使用0.1 mm的球磨劑，即使破碎細(xì)菌也使用0.25~0.5 mm的玻璃珠。其原因有三：一、用0.1 mm的玻璃珠破碎速度雖高，時(shí)間短，若破碎時(shí)間控制不嚴(yán)，對(duì)酶有破壞作用，破碎物的酶活會(huì)下降；二、小珠機(jī)械研磨產(chǎn)生熱量高；三、選擇狹縫分離器時(shí)，狹縫的大小應(yīng)當(dāng)是使用的研磨劑直徑的三分之一，使用0.1 mm的玻璃珠，狹縫應(yīng)選用0.03 mm的，這樣的狹縫分離很慢，大規(guī)模破碎時(shí)很困難。玻璃珠作球磨劑，使用100 h的損失不超過(guò)3%，一年后檢查分離器通道無(wú)重大變化，說(shuō)明玻璃珠可以長(zhǎng)期反復(fù)使用。還發(fā)現(xiàn)使用的玻璃珠大小與酶在細(xì)胞內(nèi)的位置及細(xì)胞濃度有關(guān)。

4.3.3.2裝量的影響

使用無(wú)鉛玻璃珠作球磨劑，一般的裝量為研磨容器容積的80~85%。隨球磨劑裝量的降低，細(xì)胞破碎效率也降低，同時(shí)研磨過(guò)程中產(chǎn)生的熱量也減少。因此，如果破碎釋放的活性物質(zhì)不耐熱，而且設(shè)備冷卻又差，需適當(dāng)減少球磨劑的裝量。另外，若細(xì)胞懸浮液或破碎物的粘度很高時(shí)，也需適當(dāng)降低球磨劑的裝量。

4.3.4攪動(dòng)速度

 Dyno-mill 的攪動(dòng)軸有四個(gè)轉(zhuǎn)速，即2000，3000，4500和6000 r/min，相應(yīng)的攪拌葉輪的線速度為6.9，10，15和20 m/s。

在球磨細(xì)胞破碎過(guò)程中，馬達(dá)驅(qū)動(dòng)軸帶動(dòng)攪拌葉轉(zhuǎn)動(dòng)是細(xì)胞破碎的維一能量來(lái)源。因此，攪拌葉的轉(zhuǎn)速?zèng)Q定著細(xì)胞破碎的速度和程度。大多數(shù)試驗(yàn)證明，細(xì)胞破碎速率隨攪拌葉轉(zhuǎn)速的增加而增加，但在很高的轉(zhuǎn)速下細(xì)胞破碎速率不會(huì)成比例增加，有時(shí)還可能下降。

4.3.5葉輪結(jié)構(gòu)

經(jīng)常使用的攪動(dòng)葉輪有兩種，一種是由聚氨基甲酸酯材料制造，具有開(kāi)放式的結(jié)構(gòu)；另一種是用不銹鋼制造的，結(jié)構(gòu)上不如聚氨基甲酸酯的開(kāi)放。不同材質(zhì)和結(jié)構(gòu)的攪動(dòng)葉輪在操作中因攪動(dòng)效果的差異，使破碎系統(tǒng)的溫度變化也不同。在低轉(zhuǎn)速下，較開(kāi)放的聚氨酯葉輪的破碎效率較低，這是由于反逆作用所造成的。在高轉(zhuǎn)速下，有較高的攪動(dòng)效率，且能耗也增加。

為增加攪動(dòng)效率，可以使攪拌葉安裝成與軸有一定角度，其作用是增加分散能力，但這樣會(huì)使連續(xù)破碎的能力減??；因增加了能量到細(xì)胞懸浮液中的傳遞能力，而有較高的破碎速度，但能量效率降低，特別是在高轉(zhuǎn)速下。

4.3.6流速

細(xì)胞破碎與攪動(dòng)速度有關(guān),在高攪動(dòng)速度下，流速的變化對(duì)細(xì)胞破碎率影響較小，而在低的攪動(dòng)速度下，流速對(duì)破碎率的影響較大。

4.3.7溫度

目前還沒(méi)有溫度對(duì)破碎過(guò)程影響的詳細(xì)研究報(bào)告，由于破碎為產(chǎn)熱過(guò)程，直接影響破碎物的粘度及酶的活性和蛋白質(zhì)總量的釋放，一般來(lái)說(shuō)，破碎溫度越高，細(xì)胞蛋白質(zhì)的釋放量越低。

5 兩種方式的比較：

    高壓勻漿法同高速珠磨法相比各有特點(diǎn), 間歇處理少量樣品時(shí), 勻漿法優(yōu)于珠磨法。前者操作參數(shù)少, 易于確定,而且樣品損失量少, zui少可處理20ml懸浮液。珠磨機(jī)操作參數(shù)多, 一般憑經(jīng)驗(yàn)估計(jì), 并且珠子之間的液體損失使一次處理懸浮液zui終只能得到左右的漿液。連續(xù)操作時(shí)珠磨機(jī)顯示出*性, 首先它兼具破碎和冷卻雙重功能, 減少了產(chǎn)物失活的可能性, 而高壓勻漿器需配備換熱器進(jìn)行級(jí)間冷卻其次珠磨法破碎效率高, 在適當(dāng)條件下一次操作就能達(dá)到較高的破碎率, 而高壓勻漿法往往需循環(huán)一次才行再者幾乎所有種類(lèi)的微生物細(xì)胞都可以用珠磨機(jī)破碎, 包括含有包含體的基因工程菌的破壁, 質(zhì)地堅(jiān)硬的包含體可以充當(dāng)研磨劑, 更有利于細(xì)胞破壁, 而高壓勻漿器則有一定的局限性。

6 細(xì)胞破碎技術(shù)研究的發(fā)展方向：

6.1多種破碎方法相結(jié)合

化學(xué)法與酶法取決于細(xì)胞膜壁的化學(xué)組成，機(jī)械法取決于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度，而化學(xué)組成又決定了結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度，組成的變化必然影響到強(qiáng)度的差異，這就是化學(xué)法或酶法與機(jī)械法相結(jié)合的原理。

6.2與上游過(guò)程相結(jié)合

在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基、生長(zhǎng)期、操作參數(shù)如、溫度、通氣量、稀釋率等因素對(duì)細(xì)胞破碎都有影響，因此細(xì)胞破碎與上游培養(yǎng)有關(guān)。另一方面用基因工程的方法對(duì)菌種進(jìn)行改造也是非常重要的。這方面的工作包括以下幾個(gè)方面：包含體的形成、克隆噬菌體溶解基因、耐高溫產(chǎn)品的基因表達(dá)。

6.3與下游過(guò)程相結(jié)合

細(xì)胞破碎與固一液分離緊密相關(guān)，對(duì)于可溶性產(chǎn)品來(lái)講，碎片必須除凈，否則將造成層析柱和超濾膜的堵塞，縮短設(shè)備的壽命。因此必須從后分離過(guò)程的整體角度來(lái)看待細(xì)胞破碎操作，機(jī)械破碎操作尤其如此。

7 總結(jié)：

細(xì)胞破碎技術(shù)的發(fā)展極大程度上也推動(dòng)了細(xì)胞胞內(nèi)產(chǎn)物工業(yè)化的生產(chǎn)。在運(yùn)用細(xì)胞破碎方法時(shí)，要分析實(shí)際需求、結(jié)合前人經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)也可多種方法結(jié)合使用，以求達(dá)到性?xún)r(jià)比zui大化。

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