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OVCAR4細(xì)胞|慧穎科研用|人卵巢癌細(xì)胞（細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的生物污染類型有7種，分別是細(xì)菌污染、支原體污染、原蟲(chóng)污染、黑膠蟲(chóng)污染、真菌污染、病毒污染以及非細(xì)胞污染，那么他們污染細(xì)胞的特點(diǎn)分別是什么呢？怎樣能夠減少污染現(xiàn)象的發(fā)生？）

1-細(xì)菌

細(xì)菌污染常見(jiàn)的有大腸桿菌，葡萄球菌等。細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn)，在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，培養(yǎng)液一般會(huì)在短時(shí)間內(nèi)變黃，有時(shí)靜置的培養(yǎng)液不混，稍加震蕩會(huì)有很多混濁物漂起。顯微鏡下可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時(shí)在細(xì)胞表面及周圍有大量細(xì)菌存在，細(xì)胞停止生長(zhǎng)并有中毒表現(xiàn)。

處理：①在培養(yǎng)液中加入相應(yīng)的抗生素，能夠預(yù)防絕大多數(shù)的細(xì)菌污染。

2-真菌

真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中zui常見(jiàn)的一種，尤其梅雨季節(jié)快要到了，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)更易污染。污染細(xì)胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見(jiàn)，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見(jiàn)于細(xì)胞之間縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀、管狀、及樹(shù)枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。

很多菌絲在高倍鏡可見(jiàn)到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長(zhǎng)。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲相混淆。

真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但zui后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。真菌生長(zhǎng)的比較慢，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了。

3-支原體

支原體的大小介于細(xì)菌和病毒之間，是一種獨(dú)立生活的微生物。對(duì)熱敏感，對(duì)一般抗生素不敏感。支原體的形態(tài)多變，多吸附在細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。電鏡下觀察，中心有高密度的密集顆粒，橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似。

因國(guó)內(nèi)的血清大多數(shù)都沒(méi)有做支原體陰性檢測(cè)，而支原體又是牛血清中zui常見(jiàn)的微生物之一。支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)液輕微發(fā)生混濁．但細(xì)胞變化不顯著，隨著細(xì)胞的培養(yǎng)會(huì)慢慢死亡。

支原體污染檢測(cè)（熒光染色法）：DNA和與DNA特異性結(jié)合的熒光染料結(jié)合，使得支原體的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。

解決：

1）抗生素排除法：支原體污染預(yù)防比解決好。如果不小心污染后，可加入高濃度抗生素（常規(guī)使用的5倍濃度）作用24-48小時(shí)，再換入常規(guī)培養(yǎng)液，但該法不保證有效。推薦用量：慶大霉素 200μg/ml ,四環(huán)素10μg/ml ，卡那霉素50μg/ml 。

2）加溫除菌：支原體不耐熱，可以對(duì)支原體污染的細(xì)胞熱處理除菌。因高溫對(duì)細(xì)胞本身也會(huì)產(chǎn)生一定影響，故熱處理前需先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定對(duì)細(xì)胞影響zui小而能zui大程度的殺死支原體的時(shí)間。

4-黑膠蟲(chóng)

黑膠蟲(chóng)的存在目前尚有爭(zhēng)議，其在低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見(jiàn)黑色的小蟲(chóng)游來(lái)游去，培養(yǎng)液也是不渾的，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不會(huì)有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失，除更換血清外無(wú)須特殊處理。

5-原蟲(chóng)

培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多，輕微活動(dòng)，細(xì)胞雖然可以生長(zhǎng)但繁殖速度卻明顯減慢，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會(huì)與細(xì)胞爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細(xì)胞站優(yōu)勢(shì)所以不會(huì)影響到細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時(shí)就會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)，zui終形成惡性循環(huán)。

6-病毒

組織細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，如果沒(méi)有除去潛在的病毒，就會(huì)產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。 盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

7-非同種細(xì)胞污染

即細(xì)胞交叉污染，由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒(méi)有嚴(yán)格分開(kāi)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無(wú)效。非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。

污染是細(xì)胞培養(yǎng)的大敵，預(yù)防和避免污染是成功培養(yǎng)細(xì)胞的關(guān)鍵之一。危機(jī)意識(shí)要貫徹實(shí)驗(yàn)的始終，否則不僅浪費(fèi)時(shí)間，而且浪費(fèi)人力、物力，甚至造成無(wú)法彌補(bǔ)的損失。

（如何預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)的污染和清除這些污染物呢？）慧穎 細(xì)胞庫(kù) 技術(shù)為您解答：

一、污染的預(yù)防

預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生污染的辦法。只有預(yù)防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到zui小程度。一般預(yù)防可從以下幾方面著手：

1-從操作者做起

1操作者責(zé)任心要強(qiáng)，要細(xì)心穩(wěn)重，操作技術(shù)要熟練。進(jìn)無(wú)菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘，按規(guī)定穿隔離衣。進(jìn)入后關(guān)好門，坐下來(lái)盡量少走動(dòng)。工作開(kāi)始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴(yán)格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無(wú)菌室內(nèi)，更不能隨便使用，以免造成大批污染。

2、操作者動(dòng)作要輕，必須在火焰周圍無(wú)菌區(qū)內(nèi)打開(kāi)瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼。操作時(shí)盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。

3、操作時(shí)要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)收拾，保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊，zui后用消毒水浸泡的紗布擦臺(tái)面。

2-從物品、用品消毒滅菌著手

細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要*，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì)，并在無(wú)菌試驗(yàn)陰性后才能使用。操作室及剩余的無(wú)菌器材要定期清潔消毒滅菌。

3-防止細(xì)胞交叉污染

在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，做上標(biāo)記便于辨別。并按順序進(jìn)行操作，避免一起進(jìn)行時(shí)易發(fā)生混亂。

在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。

所有細(xì)胞一旦購(gòu)置，或從別處引入，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇，重新培養(yǎng)。

二、污染的清除

培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價(jià)值不大，宜棄之；有細(xì)胞株留存的或可購(gòu)置的，可在尋找原因后*消毒操作室，復(fù)蘇或重新購(gòu)置細(xì)胞，再培養(yǎng)。若污染細(xì)胞價(jià)值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。

1-使用抗生素

抗生素對(duì)殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。預(yù)防用藥一般用雙抗生素（青霉素100u/mL加鏈霉素100μg/mL），污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外，還可用慶大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四環(huán)素、制霉菌素等。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四環(huán)素處理，每隔2～3日換液1次，傳1～2代進(jìn)行治療。近年來(lái)有報(bào)道，4-氟，2-羥基喹啉（Ciprofloxacin,Cip）、截耳素衍生物（Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四環(huán)素衍生物（BM-2）等三種抗生素單用或合用對(duì)殺滅支原體有效。這三種抗生素均用PBS配成250濃縮液，-20℃保存?zhèn)溆?，使用濃度Cip為10μg/mL，BM-1為10μg/mL，BM-2為5μg/mL。使用時(shí)先吸除污染的培養(yǎng)液，加入含BM-1的RPMI1640培養(yǎng)液，3天后再吸除培養(yǎng)液，加入含BM-2的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)4天，如此連續(xù)3個(gè)輪次，直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后，再加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代3-4次。

2-使用支原體特異性血清

用5%的兔支原體免疫血清（血凝效價(jià)1:320以上）可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長(zhǎng)，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個(gè)月后仍為陰性。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟(jì)。

3-加溫處理

將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時(shí)，可殺死支原體，但對(duì)細(xì)胞有不良影響。所以在處理前要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，摸索能zui大限度殺死支原體又對(duì)細(xì)胞影響zui小的加熱時(shí)間。此法有時(shí)不可靠。若先用藥物處理后，再以41℃加溫處理效果更佳。

4-其他方法

除了上述去除污染的方法外，還有動(dòng)物體內(nèi)接種除菌法、巨噬細(xì)胞吞噬法、污染培養(yǎng)瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過(guò)濾法等，但均較麻煩，且效果不確定。所以一旦支原體污染，除非有特別重要價(jià)值，一般均棄之重新培養(yǎng)。

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